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數(shù)字PCR（ddPCR）——拷貝數(shù)變異（CNV）驗證的精準利器

發(fā)布時間： 2026-08-10　　點擊次數(shù)： 67次

原發(fā)性免疫缺陷?。?/span>PID）是一類主要由單基因突變導致的罕見遺傳性疾病。隨著二代測序（NGS）和Sanger測序的普及，大部分致病性單核苷酸變異（SNV）和小片段插入缺失（indel）得以被識別。然而，由大片段插入或缺失導致的拷貝數(shù)變異（CNV）卻常常成為漏網(wǎng)之魚——Sanger測序?qū)?/span>CNV的檢出能力有限，可能將雜合性大片段缺失誤判為野生型。
當常規(guī)測序“看不到"CNV時，怎么辦？
發(fā)表在 Clinical and Experimental Immunology 上的一項研究給出了答案：微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）是一種可用于CNV驗證的高效、經(jīng)濟的方法。研究團隊采用Bio-Rad QX200 ddPCR系統(tǒng)，成功在3類PID患者中驗證了 NFKB1、SERPING1 和 SH2D1A 基因的大片段缺失。
ddPCR憑什么脫穎而出？
絕對定量，無需標準曲線：ddPCR將反應體系分割成數(shù)萬個微滴，通過計數(shù)陽性微滴直接得出靶分子的絕對拷貝數(shù)。與傳統(tǒng)qPCR依賴標準曲線不同，ddPCR不依賴Ct值，結(jié)果更精準、重復性更好。
精準分辨微小拷貝數(shù)差異：ddPCR能夠有效區(qū)分濃度差異微小的樣品（如1.1倍差異），甚至可分辨1倍以內(nèi)的拷貝數(shù)差異。這對于區(qū)分雜合缺失（1拷貝）與正常（2拷貝）至關(guān)重要。
成本可控，靈活適配：研究指出，對于人口較少國家或罕見病檢測場景，ddPCR的EvaGreen染料法比探針法和MLPA更具成本效益。對于小基因（10-12個外顯子以內(nèi)）或家系隔離分析，ddPCR尤為適用。
三個真實案例，見證ddPCR的實力
案例一：NFKB1基因缺失（CVID樣疾?。?/span>
一位61歲女性患者（Patient 1）因泛低丙種球蛋白血癥、特發(fā)性血小板減少等表現(xiàn)被診斷為疑似CVID。NGS基因panel檢測提示 NFKB1 外顯子2和3雜合缺失。研究團隊采用EvaGreen染料法ddPCR，以AP3B1和RPP30為雙參考基因，確認該患者兩外顯子拷貝數(shù)分別為0.88和0.92（正常為2），而其女兒（Patient 2）拷貝數(shù)正常（1.94和1.96），排除了攜帶風險。
案例二：SERPING1基因外顯子4缺失（遺傳性血管性水腫，HAE）
一位5歲男性患兒（Patient 3），其母親和祖母均為1型HAE（C1抑制劑缺乏癥）患者。Sanger測序未檢出 SERPING1 基因致病性變異。但采用探針法ddPCR檢測發(fā)現(xiàn)，該患兒 SERPING1 外顯子4為單拷貝（雜合缺失），其余7個外顯子均為雙拷貝。該結(jié)果隨后經(jīng)MLPA外部驗證一致。
案例三：SH2D1A基因外顯子1缺失（X連鎖淋巴增生綜合征，XLP）
一名疑似XLP的男性患者（Patient 4），常規(guī)PCR無法擴增 SH2D1A 外顯子1。MLPA和ddPCR雙雙證實其為外顯子1半合子缺失（男性僅1條X染色體），該缺失將導致翻譯起始密碼子丟失、蛋白功能喪失。
ddPCR vs. MLPA：互補而非替代
MLPA長期以來是CNV檢測的金標準。但ddPCR在某些場景下展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢：ddPCR對低比例嵌合體CNV的檢測可能比MLPA更靈敏；在定量精度方面，部分研究顯示dPCR在SMN1/SMN2拷貝數(shù)定量上優(yōu)于MLPA；且ddPCR耗時更短、成本更低。兩種技術(shù)可互為補充。
[1]Woon ST, Mayes J, Quach A, et al. Droplet digital PCR for identifying copy number variations in patients with primary immunodeficiency disorders. Clin Exp Immunol. 2022;207(3):329-335.

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